Zellaufschluss

Als Zellaufschluss werden in der Biochemie Verfahren bezeichnet, bei denen Zellen zerstört werden, um an deren Inhalt (meist Proteine, DNA oder mRNA) zu gelangen.

Aufschlussverfahren

Mechanische

Mechanische Aufschlussverfahren führen meist zu einem Temperaturanstieg, deshalb muss die Temperatur kontrolliert werden und wenn nötig das Aufschlussgut im Eisbad gekühlt oder der Aufschluss mit Unterbrechungen durchgeführt werden.

Tierische und pflanzliche Zellen müssen vor dem Aufschließen von unerwünschten Gewebeteilen befreit werden indem man sie zunächst mittels Schere, Skalpell oder Fleischwolf grob zerkleinert.

• Tierische und pflanzliche Zellen: Homogenisieren in einem Mixer mit rotierenden Messern (Ultra-Turrax bei kleinem Volumen). Beide Verfahren können schäumen!
• Potter-Elvehjem Verfahren, wenn die Zellorganellen erhalten bleiben sollen (bewegter Kolben, eng ummantelt von stationärem Gefäß → Scherkraft)
• Alle Zellen, besonders Mikroorganismen: Bei kleinen Volumina im Mörser mit Sand oder Al₂O₃. zerreiben. Glasperlenmühle, oder Ultraschall (--> Kavitationskraft, Zusammenstoß von Zellen) für grössere Volumina (Wärmeentwicklung bei all diesen Verfahren!)
• Für kontinuierlichen Betrieb oder Volumen >1000 ml unter großem Druck durch ein enges Ventil pressen (Manton-Gaulin Homogenisator)-->Kavitationskraft; Aufschluss unter Druck im kleinen Massstab mittels French-Press (gleiches Prinzip wie Manton-Gaulin Homogenisator)

Nicht-mechanische

Nicht-mechanische Aufschlussverfahren werden bei Zellen angewandt, welche sich nicht einfach aufbrechen lassen (z.B. Hefe). Sie sind meist schonender als die mechanischen Verfahren.

• Tierische und pflanzliche Zellen: Zyklen von Einfrieren und Auftauen (--> Scherkraft) oder Behandlung mit hypotonischen Pufferlösungen (--> lyse der Zellen). Beide Methoden führen zu keiner vollständigen Homogenisierung!
• Hefezellen: Autolyse mit Toluol ergibt Löcher in Zellmembran oder enzymatische Lyse mit Zymolyase (zerstört Glucan-Zellwand) und Triton X-100 (Zerstörung der Zellmembran).
• Gram-positive Bakterien: Behandlung mit Lysozym (zerstört Peptidoglycanhülle) und anschließend mit Triton X-100 (-->lyse der Zellmembran)
• Gram-negative Bakterien: muss zuerst mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (Lösen des Lipopolysaccharid der äußeren Zellmembran), dann mit Lysozym (zerstört Peptidoglycanhülle) und letztendlich mit Triton X-100 (lyse der inneren Zellmembran) behandelt werden.

Schutz der Proteine

Durch den Aufschluss der Zellen gelangen die Proteine in eine unphysiologische Umgebung und müssen vor Inaktivierung, Denaturierung und Degradation geschützt werden.

pH-Veränderung durch metabolische Prozesse

• Ausreichende Pufferung
• Ggf. Nachstellen des pH-Wertes durch Zugabe von Ammoniak- bzw. Tris(hydroxymethyl)aminomethane-Lösung (Tris)

Inaktivierung durch Oxidation von SH-Gruppen

• Zugabe von Dithioerythritol oder 2-Mercaptoethanol zur Pufferlösung (im mM-Konzentrationen)

Schwermetallionen reagieren mit reaktive Gruppe des Proteins oder divalente Kationen (Ca²⁺, Mg²⁺) aktivieren abbauende Enzyme

• Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in mM-Konzentrationen zugeben (bildet Metallkomplexe mit Metallen)

Zu geringe Ionenstärke, <0.05M (schlechte Ausbeute, da sich Proteine an Zelltrümmer anheften)

• Aufschluss-Pufferlösung sollte ca. 0.05-0.1M NaCl oder KCl enthalten

Aggregation der Proteine (hydrophobe Wechselwirkungen)

• Zugabe von nicht-ionischen Detergenzien wie Triton-X-100 (ca. 0.02% w/v) oder Lubrol PX (ca. 0.006% w/v)

Proteasen werden während des Aufschließens freigesetzt

• Schnell arbeiten
• Temperatur nahe an 0°C halten
• Inhibierung durch Proteasehemmer (Tabelle mit Proteasehemmern z. B. inArbeitsmethoden d. Biochemie S. 47, Tab. 3-1 oder in anderer enschlägiger Literatur)