Er entspringt als Río Guainía im Südosten von Kolumbien. Seine Quelle befindet sich in der dortigen Provinz Guainía, von der sein Wasser anfangs nach Osten fließt, um später nach Süden abzuknicken und die Grenze von Kolumbien und Venezuela zu bilden.
In diesem Bereich heißt er sowohl Río Guainía als auch Rio Negro. Dort ist der Fluss über den Brazo Casiquíare, ein kanalartiger Seitenarm des Río Casiquíare, durch eine Bifurkation mit dem östlicher und gen Norden fließenden Orinoco in Venezuela verbunden.
Danach wendet er sich im brasilianischen BundesstaatAmazonas nach und nach in Richtung Osten, wird vom Rio Uaupés gespeist, und bildet kurzeitig die Grenze zum benachbarten Bundesstaat Roraima, an der ihm sein größter Nebenfluss zufließt - der Rio Branco.
Nach der Einmündung des Uaupés verästelt sich der mäanderndeRio Negro in viele Arme und bildet dadurch einen teils bis zu 20 km breiten Flusslauf bzw. ein ausgedehntes Überschwemmungsland. Spätestens nach dem eben erwähnten Grenzlauf wendet er sich nach Südosten, um bei Manaus in den Amazonas zu münden; letzterer heißt vom DreiländereckBrasilien-Kolumbien-Peru bis zu dieser Einmündung Rio Solimoes.
Schwarzwasser
Der Rio Negro ist wegen seines hohen Gehaltes an Huminsäuren und Fulvosäuren, die vom Regen in seinem Einzugsgebiet aus den bereits stark ausgelaugten, sandigen Böden der Terra firme gewaschen worden sind, braun gefärbt, aber relativ klar und wirkt daher optisch etwa wie Cola oder Kaffee (Schwarzwasserfluss).
Durch die Nährstoffarmut gibt es im Rio Negro keine Mückenlarven und daher (wie auch in Manaus) praktisch keine Malaria.
Nach der eben erwähnten Einmündung des Rio Negros kann das Schwarzwasser noch einige Kilometer von den milchig-braunen Farben des Amazonas-Wassers unterschieden werden.
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