Hofmann studierte ab 1836 in Giessen Chemie bei Justus von Liebig, wurde dessen Assistent, promovierte 1843 bei ihm und ging nach seiner Habilitation 1845 als Privatdozent für Chemie an die Universität Bonn. Auf Empfehlung Liebigs und auf Wunsch des englischen Prinzgemahls Albert übernahm er noch im gleichen Jahr eine Professur am Chemischen Institut der Royal School of Miners in London. Zugleich wurde er mit der Errichtung des College of Chemistry in London beauftragt, dessen Leitung ihm nach der Fertigstellung übertragen wurde, und wo er zahlreiche englische Chemiker ausbildete. Später war er maßgeblich an den Vorbereitungen der Weltausstellungen 1851 und 1862 in London beteiligt.
Nach dem frühen Tode des Prinzgemahls ging er 1864 als ordentlicher Professor nach Bonn und erhielt im folgenden Jahre einen Ruf nach Berlin, wo er bis zu seinem Tode blieb. Hier wurde er 1867 Mitbegründer der Deutsche Chemische Gesellschaft und deren erster Präsident.
Schon in seiner Dissertation über die Basen des Steinkohlenteers hatte Hofmann die Existenz von Chinolen und Anilin nachgewiesen. Diesen Verbindungen und ihren Derivaten blieb er sein Leben lang treu. Er lehrte zwar allgemeine organische Chemie, aber in der Forschung widmete er sich vor allem den Aminen und den sich vom Anilin ableitenden Farbstoffen. Er entdeckte auch die Vitalfarben, die die Epoche machenden Arbeiten von Robert Koch, Paul Ehrlich und Emil von Behring in der Erforschung der Bakterien ermöglichten.
Auf der Grundlage dieses Wissens entstanden die deutschen I.G.Farben-Werke, die Deutschlands Chemie zur Weltgeltung verhalfen.
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