DNA-Sequenzierung

DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der DNA-Sequenz, also der Nukleotid-Abfolge, von genomischer DNA. Auf diese Weise konnte seit 1995 das Genom von über 150 verschiedenen Organismen analysiert werden (s. Sequenzierte Organismen).

Die Sequenzierung kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, wobei es drei praktisch verwendbare Methoden zur Bestimmung der eigentlichen Nukleotidabfolge gibt. An die Sequenzierung schließt sich in der Regel die DNA-Sequenzanalyse an.

Sequenzierung im großen Maßstab, wie für das Humangenomprojekt stellte die bisher größte Herausforderung für die Bioinformatik dar.

Sequenzierungsmethoden

Maxam und Gilbert Methode

Die Methode der chemischen Spaltung nach Maxam und Gilbert (1977) diente ihren Erfindern zur erfolgreichen Bestimmung der Operon-Sequenz eines Bakteriengenoms. Sie wurde vedrängt von der zwar zeitgleich unabhängig entstandenen, aber schnelleren und leichter automatisierbaren

Didesoxymethode nach Sanger

Die Didesoxymethode wird auch "Kettenabbruch-Synthese" genannt und von Sanger um 1975 entwickelt und ebenfalls 1977 mit der ersten vollständige Sequenzierung eines Genoms (Bakteriophage φX174 ^[1]) vorgestellt.

Man verwendet dazu heutzutage die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Klassischerweise werden in vier sonst gleichen Ansätze je eine unterschiedliche Base als Didesoxynukleotid (ddNTP) zugegeben. Ohne die Hydroxygruppe ist eine DNA-Verlängerung durch eine DNA-Polymerase nicht möglich und es kommt zum Kettenabbruch. Da die ddNTPs zufällig eingebaut werden, bricht die DNA-Synthese an verschiedenen Stellen ab. Nach der PCR wird jeder Ansatz getrennt mittels Gelelektrophorese getrennt und man kann die Sequenz anhand des Gels ablesen.

Seit Anfang der neunziger Jahre werden vor allem mit verschiedenen Fluoreszenz-Farbstoffen markierte Didesoxynukleotide eingesetzt, diese Modifikation erlaubt es alle vier Didesoxynukleotid, also alle vier Basen, in einer Reaktion, statt durch in vier getrennten durchzuführen. Das entstehende Produkt wird ebenfalls mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und die dabei eingebauten Didesoxynukleotide werden dann durch einen Laserstrahl angeregt und entsenden infolge Fluoreszenz-Markierung Licht verschiedenen Farbe. Diese Veränderung ermöglicht auch die Automatisierung der DNA-Sequenzier, eine Vorausetzung für die vollständige Sequenzierung von großen Genomen, beispielsweise des Menschlichen oder des Genoms der Maus.

Sequenzierung durch Hybridisierung

Zu diesem Zweck werden auf einem Glasträger (DNA-Chip oder Microarray) kurze DNA-Abschnitte (Oligonukleotide) in Matrix-Anordnung fixiert. Die Fragmente der zu sequenzierenden DNA werden mit Farbstoffen markiert und das Fragmentgemisch wird auf der Oligonukleotidmatrix ausgebracht, so dass komplementäre fixierte und freie DNA-Abschnitte miteinander hybridisieren können. Nach dem Auswaschen ungebundener Fragmente lässt sich das Hybridisierungsmuster anhand der Farbmarkierungen und deren Stärke ablesen. Da die Sequenzen der fixierten Oligonukleotide und deren Überlappungsbereiche bekannt sind, kann man letztlich aus dem Farbmuster auf die zugrundeliegende Gesamtsequenz der unbekannten DNA rückschließen.

Hilfsmethoden

• Shotgun-Sequenzierung
• Chromosomal walks

Weblinks

• http://www.physik.uni-stuttgart.de/SMG/pdf/biophysueb_humangenom.pdf - sehr schöne Gesamtübersicht, nicht nur auf das Humangenom anwendbar